Είναι το καμάρι του νησιού και ένας από τους μεγαλύτερους ναούς των Βαλκανίων. Βρίσκεται στη συνοικία Βαπόρια, κοντά στην πλατεία Μιαούλη και το θέατρο Απόλλων. Αποτελεί ένα από τα πιο αξιοσημείωτα αξιοθέατα του νησιού. Τα σχέδια για την κατασκευή της εκκλησίας ξεκίνησαν το 1841 και εγκρίθηκαν από τον ίδιο τον Όθωνα. H εικόνα του Αγίου Νικολάου υφάνθηκε και αναδημιουργήθηκε στη Μόσχα το 1852.
Εγκαινιάστηκε στις 14 Σεπτεμβρίου του 1870 με δωρεές από σημαντικούς Έλληνες και ξένους ευεργέτες. Ο εντυπωσιακός σε διαστάσεις ναός βρίσκεται σε περίοπτη θέση, είναι διακοσμημένος με μάρμαρο και στο εσωτερικό του υπάρχουν κίονες, μαρμάρινο τέμπλο και περίτεχνες διακοσμήσεις. Ο ναός ξεχωρίζει για τη μεγαλοπρέπειά του και την κυρίαρχη θέση του στο τοπίο της Ερμούπολης, με τον γαλάζιο τρούλο του να είναι το σήμα κατατεθέν του νησιού.
